顧青:核糖開關用于檢測發酵食品維生素B12

 

維生素B12作為水溶性微生物,又叫钴胺素,是唯一含金屬元素钴的維生素。在人體生長代謝過程中,維生素B12可參與制造骨髓紅細胞,防止惡性貧血;防止大腦神經受到破壞,因此對于食品中維生素B12的檢測尤顯得重要。

傳統方法中,食品維生素B12含量通過微生物檢測(MA)獲得,其分析方法的靈敏度優異,但選擇性差,勞動強度大,耗時長,此外,由于食品中含有脫氧核糖核苷酸和其他類胡蘿蔔素,分析結果會高于實際維生素B12含量。近幾年核糖開關的應用越發廣泛,它是指mRNA一些非編碼區的序列折疊成一定的構象,這些構象的改變應答于體内的一些代謝分子,從而通過這些構象的改變達到調節mRNA轉錄的目的。本文将核糖開關應用于檢測維生素B12,通過腺苷钴胺直接結合核糖開關區域,導緻mRNA二級結構的構象發生變化,從而抑制表達。在這個過程中,綠色熒光蛋白的表達與腺苷钴胺素的濃度呈現負相關。

圖1. 核糖開關質粒構建示意圖

在該實驗中,将費氏丙酸杆菌DSM 20270中獲取的核糖開關通過酶切連接到質粒p519ngfp上(如圖1)。核糖開關通過結合钴胺素,抗隔離子(Antisequestor)與P3(CCCC)适體結構域形成假結,此時抗隔離子補體與RBS形成發夾結構(如圖2),終止轉錄過程的進行。對此進行了驗證實驗(如圖2),随着钴胺素濃度升高,抑制gfp的表達加強,其熒光表達減弱。

圖2. 核糖開關質粒構建示意圖及效果驗證

之後,該團隊對核糖開關傳感器的特異性及靈敏性進行了實驗。如圖3所示,通過測定,繪制核糖開關法測定維生素B12的标準曲線,發現二者呈現負相關趨勢,呈線性關系。同時測定了核糖開關傳感器對其他類咕啉化合物反應,發現MCBL和OHCBL以相似的方式抑制GFP表達;ADCBL比CNCBL更能抑制GFP表達;CNCBL是最熱穩定的形式(如圖3),因此在使用核糖開關進行測定時,钴胺素要在含有KCN的乙酸鹽緩沖液中進行加熱,形成穩定的CNCBL,可高效且穩定的進行實驗。文章中,核糖開關傳感器對其他複合物反應同樣進行實驗(如圖3),發現脫氧核糖核苷酸和光分解維生素B12不能關閉核糖開關傳感器來抑制GFP表達;複合的钴胺素中,高濃度的IF-CNCBL(750 ng / mL)和HC-CNCBL(750 ng / mL)可關閉核糖開關傳感器。核糖開關傳感器可有效排除假性維生素,對钴胺素有高效的特異選擇性。

圖3. 核糖開關法測定維生素B12的标準曲線及其對其他複合物的反應

點評:

1. 核糖開關傳感器檢測維生素B12結果與HPLC相似。

2. 核糖開關的結果比微生物測定結果低23%,可有效排除微生物測定的假性結果。

3. 該方法對核酸和假維生素B12沒有反應。

4. 靈敏度高,可在10-1000ng / mL的範圍内測定。

5. 食品中多數維生素B12與蛋白質結合,不能檢測到與蛋白質結合的維生素B12,實驗中樣品前處理方法不明确。

聲明:

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Zhang Y, Chan P, Herr A. Rapid Capture and Release of Nucleic Acids through a Reversible Photo-cycloaddition Reaction in the Psoralen-functionalized Hydrogel [J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2018, 57(9).